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郵箱：283958025@qq.com
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企業(yè)動(dòng)態(tài)
看酶標(biāo)儀時(shí)間分辨熒光技術(shù)是如何實(shí)現(xiàn)的
更新時(shí)間：2016-08-15 點(diǎn)擊次數(shù)：2565次
酶標(biāo)儀時(shí)間分辨熒光技術(shù)是以鑭系元素作為標(biāo)記物的一種免疫檢測(cè)技術(shù)。其原理是鑭系元素(如Eu3+)具有長(zhǎng)壽命的發(fā)射熒光，標(biāo)記待檢測(cè)物質(zhì)后，使用特定激發(fā)光激發(fā)，通過(guò)一定的檢測(cè)時(shí)間延遲來(lái)達(dá)到扣除本底熒光的目的，并以此來(lái)提高信噪比與檢測(cè)靈敏度。
時(shí)間分辨熒光（精度：10-18mol/L）與以下標(biāo)記免疫技術(shù)相比：
優(yōu)點(diǎn)：精度高
放射免疫（精度：10-12mol/L）早出現(xiàn)，發(fā)展成熟穩(wěn)定性差，有危害，操作繁瑣
酶聯(lián)免疫（精度：10-9mol/L）安全靈敏度、重復(fù)性差
化學(xué)發(fā)光（精度：10-15mol/L）測(cè)定速度快、靈敏度高樣品不能重復(fù)測(cè)定試劑穩(wěn)定性差，試劑價(jià)格高
電化學(xué)發(fā)光（精度：10-17mol/L）本底較小、靈敏度較高非開(kāi)放性試劑系統(tǒng)、不能做科研價(jià)格高
90年代以來(lái)，時(shí)間分辨熒光分析技術(shù)因其靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬，不受樣品自然熒光干擾，無(wú)放射性污染等特點(diǎn)，其方法學(xué)研究和臨床應(yīng)用的發(fā)展十分迅速。
用三價(jià)稀土離子及其螯合物作為示蹤物，標(biāo)記抗原、抗體、激素、核酸探針等物質(zhì)
當(dāng)反應(yīng)體系發(fā)生后，如抗原抗體免疫反應(yīng)、核酸探針雜交等反應(yīng)，經(jīng)解離—增強(qiáng)作用，用時(shí)間分辨熒光儀，測(cè)定后產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度。
根據(jù)熒光強(qiáng)度和相對(duì)熒光強(qiáng)度比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，達(dá)到定量分析的目的.。
常規(guī)熒光免疫測(cè)定技術(shù)易受待測(cè)樣品中非特異本底熒光的干擾，靈敏度受到一定限制。于是，20世紀(jì)80年代初，在常規(guī)熒光免疫分析的基礎(chǔ)上發(fā)展了一種新型免疫分析技術(shù)——時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定(time-resolvedfluoroimmunoassay，TRFIA)。其原理和方法與常規(guī)熒光免疫不同，所用標(biāo)記物不是普通熒光物質(zhì)，而是鑭系稀土元素銪(Eu3+)、釤(Sm3+)、鋱(Tb3+)等[8]，檢測(cè)設(shè)備也不同于一般的熒光分光光度計(jì)，而是使用時(shí)間分辨熒光計(jì)測(cè)量排除樣品中非特異熒光的干擾，極大地提高了測(cè)定方法的靈敏度[9]。TRFIA在靈敏度、特異性、穩(wěn)定性及測(cè)量自動(dòng)化程度等方面都可與放射免疫測(cè)定(RIA)相媲美，而其標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬(跨越4—5個(gè)數(shù)量級(jí))，小檢出值可達(dá)10—18mol／L，分析速度快，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)RIA、EM及發(fā)光免疫測(cè)定，并具操作簡(jiǎn)便，無(wú)放射性污染，因此成為免疫分析中具發(fā)展?jié)摿Φ囊豁?xiàng)技術(shù)[10]。TRFIA的基本原理是：將鑭系元素銪(Eu3+)、釤(Sm3+)、鋱(Tb3+)等通過(guò)具有雙功能基團(tuán)的螯合劑標(biāo)記于抗體(或抗原)分子上。當(dāng)標(biāo)記抗體和待測(cè)抗原結(jié)合，采用紫外脈沖光(340nm，每秒閃爍1000次)進(jìn)行激發(fā)，不僅發(fā)射出高強(qiáng)度的熒光(613nm)，而且衰變時(shí)間也較長(zhǎng)(10～1000us)。利用延緩測(cè)量時(shí)間，待短壽的本底熒光(樣品池和待測(cè)樣品中蛋白質(zhì)等自然發(fā)生的非特異性熒光，衰變時(shí)間1—10ns)全部衰變后，再行測(cè)量，所得信號(hào)*為長(zhǎng)壽命鑭系元素螯合物的特異熒光，從而有效排除非特異本底熒光的干擾，大大提高分析的特異性和靈敏度。此外，Eu3+或Sm3+的激發(fā)光與發(fā)射光之間有很大的Stokes位移，而且激發(fā)光的光譜較寬，有利于增高激發(fā)能，增強(qiáng)標(biāo)記物的比活性；且發(fā)射熒光的譜帶很窄，有助于降低本底，從而提高分析的特異性和靈敏度。
